Экстракция в аналитической биохимии и при выделении ксенобиотиков

6. Пробоподготовка в аналитической токикологии

При разработке методик определения лекарственных препаратов в крови и других биологических жидкостях часто возникают проблемы, связанные с мешающим воздействием биологической матрицы на количественное определение аналитов (интерференция). Выявление подобных проблем и поиск путей их устранения весьма актуальны.

Большинство лекарственных веществ имеет высокую степень связывания с белками крови. Поэтому при изучении токсикокинетики определение лекарств рекомендуется проводить именно в плазме крови, которая имеет сложную матрицу, существенно отличающуюся по составу для разных доноров. Согласно международным рекомендациям Европейского Медицинского Агентства (EMA – European Medicines Agency) при использовании к примеру масс-спектрометрического детектирования матричный эффект должен быть оценен на образцах биологической матрицы не менее шести различных доноров

Большинство современных аналитических приборов, в том числе системы ВЭЖХ-МС, не имеют технической возможности определять малые количества лекарственных препаратов непосредственно при инжектировании образца. Матрицы биологических объектов часто очень сложны. Отделить аналит от компонентов биологической матрицы (плазмы крови) и подготовить его к вводу в прибор – основные задачи, решаемые с помощью различных подходов пробоподготовки. Наличие даже самой современной аналитической аппаратуры без грамотного выбора стратегии процедуры пробоподготовки не может гарантировать успеха при разработке методики определения лекарственного препарата в плазме крови. Это связано не только с предельно низкими концентрациями токсинов, основных активных компонентов лекарственных средств (ЛС) и их метаболитов, но и с биологической активностью определяемых соединений, термолабильностью, многокомпонентностью матрицы образца, наличием оптических изомеров. Именно поэтому правильный выбор процедуры пробоподготовки часто является ключевым моментом при разработке методики определения лекарственного препарата в плазме крови. При проведении практически любого исследования подготовка пробы к анализу занимает наибольшее количество времени рис. 16. Кроме того, она является источником более 30% ошибок количественного определения аналитов.

Таким образом, при выборе схемы подготовки проб к анализу необходимо учитывать не только его надежность и точность, но и такие факторы как простота эксплуатации, время, необходимое для выполнения процедуры. Современными тенденциями в пробоподготовке являются миниатюризация, автоматизация, он-лайн соединение с аналитическим прибором, уменьшение расхода растворителей и увеличение скорости и безопасности (особенно при использовании потенциально инфекционных образцов биологического материала). Минимизация количества стадий при подготовке образцов необходима для снижения возможных ошибок, что приводит и к повышению точности. Автоматизированные методы пробоподготовки также весьма эффективны в плане экономии времени, улучшения воспроизводимости, но при этом включают и дополнительные расходы. Кроме того, часто требуется количественное определение не одного аналита, а целой группы, что имеет место, например, при анализе в плазме крови действующего лекарственного препарата и его метаболитов. Еще одной причиной необходимости определения группы аналитов в плазме крови является оптимизация комплексной терапии, когда пациенту назначают сразу несколько препаратов, концентрация которых контролируется.

Описаны примеры с одновременным определением 10 аналитов психотерапевтического действия, 13 противовоспалительных препаратов 40, 15 противовирусных препаратов. Соответственно, метод пробоподготовки должен учитывать химическую специфику всех аналитов.

Применение метода внутреннего стандарта для количественного определения лекарственных препаратов в плазме крови уже давно считается стандартным приемом. Существуют общие стратегии выбора внутреннего стандарта: он должен иметь близкую по отношению к определяемым веществам структуру, сопоставимые коэффициенты распределения. Нередко применяют внутренние стандарты, меченые изотопными атомами. По сути, это – то же самое анализируемое вещество с массой, отличающейся на один или несколько Да. Их идентичное химическое поведение позволяет повысить воспроизводимость и снизить матричный эффект. Однако стоимость подобных стандартов довольно высока. Авторы предлагают синтезировать меченые внутренние стандарты непосредственно в лаборатории методом метаболической инкубации. Другой подход предложен в, а именно: методика выбора дериватизирующих агентов, аналогичных определяемому аналиту, которые будут выступать в качестве внутренних стандартов. Метод получил название изотопно- кодовой дериватизации (ИКД). Применяют реагенты для мечения функциональных групп в аминах, карбоновых кислотах, тиолах, спиртах и др. Выделяют три основных подхода при подготовке биологической матрицы к анализу: осаждение белков, жидкостно-жидкостная экстракция и сорбционное концентрирование (твердофазная экстракция).