Экстракция в аналитической биохимии и при выделении ксенобиотиков

6. Пробоподготовка в аналитической токикологии

6.1. Осаждение белков

Биологические матрицы представляют собой сложные смеси эндогенных компонентов, таких как белки, соли, липиды, которые могут взаимодействовать с аналитами в процессе разделения и хроматографического определения. Белки, в значительных количествах присутствующие в плазме крови, могут необратимо адсорбироваться на хроматографической колонке, что приведет к ухудшению эффективности и резкому сокращению срока службы колонки.

Наиболее простой и быстрой процедурой удаления белков биологической матрицы является их осаждение различными реагентами. Наиболее распространенными осадителями являются такие органические растворители как ацетонитрил, метанол, их смесь, добавки в органические растворители кислот и щелочей. Осаждение белков проводят и сильными кислотами: муравьиной и хлорной. Применение такого приема позволяет удалить до 98% белков плазмы крови. Процедура осаждения белков является быстрой, недорогой и простой в исполнении и может быть применена для широкого спектра аналитов. Осаждение белков может также использоваться для образцов плазмы или сыворотки крови как стадия очистки, предваряющая жидкостно-жидкостную экстракцию или сорбционное концентрирование. После осаждения белков проводится центрифугирование и отделение надосадочного слоя, который и подвергается анализу. Экспрессность является одним из основных преимуществ данного подхода. Однако, если требуются низкие пределы обнаружения аналитов, приходится проводить стадию концентрирования. Для этого растворитель из надосадочной жидкости выпаривают досуха и содержимое перерастворяют в меньшем объеме перед вводом в колонку.

Основным недостатком осаждения белков считают недостаточную степень извлечения. Так, ряд авторов отмечают, что степень извлечения аналита при осаждении белков обычно не превышает 60%, что вызвано соосаждением аналита с белками плазмы крови и сложностью биологической матрицы. Кроме того, эффекты влияния остаточных компонентов после осаждения белков (матричные эффекты) выявлены в ряде масс-спектрометрических исследований с электрораспылительной ионизацией. В основном, это подавление сигнала аналита, приводящее к недостаточной чувствительности и несоответствию значений повторяемости и правильности экспериментов установленным валидационным требованиям. Именно эти недостатки ограничивают использование процедуры осаждения белков при разработке методик определения лекарственных средств в биологических жидкостях.