Экстракция в аналитической биохимии и при выделении ксенобиотиков

6. Пробоподготовка в аналитической токикологии

6.2. Жидкостно-жидкостная экстракция

Жидкостная экстракция (ЖЖЭ) – традиционный тип пробоподготовки, который отличается селективностью извлечения, несложной реализацией и невысокой стоимостью. Чаще всего при разработке биоаналитической методики применяют наиболее простой – распределительный вариант жидкостно-жидкостной экстракции. Для этого к биологическому образцу, доведенному до необходимого значения pH, добавляют органический растворитель. После перемешивания органический слой отделяют, удаляют растворитель выпариванием и производят растворение в подходящем для анализа растворе. Следует отметить, что важную роль при выборе экстрагента играют химические свойства аналита. Существует простой способ управления полярностью аналитов- кислот и аналитов-оснований с помощью рН. Ионизованные формы являются гораздо гидрофильнее их нейтральных аналогов. Вследствие этого следует ожидать большее сродство к органической фазе (высокое значение KD) в случае, когда аналит находится в нейтральном состоянии, и, соответственно, – слабое (низкое значение KD), когда молекула аналита полностью ионизована (Рис.17).


Рис.17. Зависимость коэффициента распределения от значения рН среды

При этом имеется и промежуточный диапазон, в котором сродство к той или иной фазе варьируется с изменением рН для частично ионизованных форм аналита. Описываемая кривая аналогична кривой титрования. Точка перегиба такой кривой находится при значении рН, при котором степень диссоциации составляет 50% - рКа. Кривые зависимостей «коэффициент распределения - рН» для кислот и оснований качественно являются зеркальными отображениями друг друга. В случае кислот следует ожидать увеличения сродства аналита к органической фазе при низких значения рН, а для оснований – при высоких. Наиболее распространенными экстрагентами являются трет.бутилметиловый эфир, этилацетат, их смеси с дихлорметаном или гексаном]. Для переведения определяемого вещества в форму, необходимую для лучшего извлечения, используют различные подходы. Чтобы получить более щелочную среду применяют растворы гидроксида натрия или аммония. Для подкисления плазмы до необходимого значения рН используют соляную либо муравьиную кислоту. Широкое применение для этих целей нашли буферы: ацетатно- аммонийный, фосфатный. Считается, что именно буферы помогают нивелировать различие в кислотности плазмы крови различных доноров, что улучшает воспроизводимость при последующем анализе. При всех преимуществах жидкостно-жидкостной экстракции у нее есть и ряд недостатков. К основным можно отнести трудоемкость, времязатратность и довольно большое количество манипуляций с образцом. Тем не менее, эта процедура гораздо более селективна в сравнении с осаждением белков и позволяет достигать высоких степеней извлечения.

Жидкость-жидкостная экстракция

Эффективным и распространенным методом в химико-токсикологическом анализе яв­ляется жидкость-жидкостная экстракция. Этот метод применяется при извлечении ее- ществ из крови, лимфы, слюны, перитонеальной жидкости, мочи и промывных вод же­лудка. Он также используется на втором этапе при изолировании ядовитых соединений из трупного материала.

Жидкость-жидкостная экстракцияэто метод выделения, разделения и концентриро­вания веществ, основанный на распределении растворенного вещества между двумя жид­кими несмешивающимися фазами. В токсикологической химии чаще всего одной жидкой фазой является вода, другойорганический растворитель. Органический растворитель должен обладать высокой растворяющей способностью для анализируемого вещества, иметь низкую температуру кипения. Однако выбор органических растворителей невелик. Наиболее часто для этой цели используют диэтиловый эфир и хлороформ. Выбор органи­ческого растворителя определяется свойствами анализируемого соединения.

В условиях равновесия отношение концентраций вещества в обеих фазах представ­ляется константой распределения  (К), которая не зависит от общей концентрации веще­ства.

К = [Со] / [Св]

где Со и Св — равновесные концентрации вещества в обеих фазах  (органической, водной) в одной и той же форме.

Однако при экстракции могут происходить различные процессы: ассоциация, дис­социация, сольватация, комплексообразование. Практическое значение при химико­токсикологическом анализе имеет отношение общих  (аналитических) концентраций экс­трагируемого вещества, которое называют коэффициентом распределения  (D).

D = Со / Св

где Со и Св — общие концентрации вещества в органической и водной фазе  (независимо от формы существования вещества).

Коэффициент распределения определяют экспериментально в реальных условиях. Его значение используют для разработки условий экстракции ядовитого вещества.

Степень извлечения  (процент экстракции) при однократной экстракции рассчиты­вают по формуле:
R =  (100
· D) /  (D+Vв/Vо)

где R — степень экстракции, %, D — коэффициент распределения, Vв и Vо — равновесные объемы водной и органической фаз.

Эта формула позволяет рассчитать объем органической фазы для определенного про­цента извлечения вещества при однократной экстракции.

Пример. Найти объем органического растворителя для извлечения 99% вещества из 100 мл водного раствора при однократной экстракции. Коэффициент распределения равен 20.

Из предыдущей формулы находим:

Vо =  (R · Vв) /  ( (100-99) ·  20)

Подставляя указанные значения R и D, находим:

Vо =  (99 · 100) /  ( (100-99) ·  20) = 495 мл

При многократной экстракции удается добиться полной экстракции значительно меньшим объемом органического растворителя. В этом случае расчет степени экстрак­ции проводится по формуле:

R = 100 · [1-  (Vв/ (D·Vo+Vв))n]

где пкратность экстракции.

Для приведенного выше примера при D=20, объеме водной фазы 100 мл достаточно использовать трехкратное извлечение органическим растворителем объемом 25 мл.

R = 100 · [1-  (100/ (20·25+100))3]

Таким образом, данным количеством растворителя можно полнее извлечь раство­ренное вещество, если проводить экстракцию многократно малыми порциями раство­рителя.

По приведенной выше формуле можно найти необходимую кратность экстракции при заданных условиях с целью достижения требуемой степени экстракции. Из выше­приведенных формул можно найти:

n = [lg  (1- (R/100))] / [lg (Vв/ (D·Vo+Vв)]

Используя данные взятого примера VB=100 мл; V0=25 мл; D=20, найдем число экс­тракций для извлечения 99% вещества:

n = [lg  (1- (99/100))] / [lg (100/ (500+100)] = -2 / -0,778 = 2,57  (округлено 3)

Добавление электролитов в водную вытяжку оказывает высаливающее действие за счет понижения растворимости ядовитых веществ в воде. В результате повышается степень их экстракции органическим растворителем.