Экстракция в аналитической биохимии и при выделении ксенобиотиков

6. Пробоподготовка в аналитической токикологии

6.3. Сорбционное концентрирование (твердофазная экстракция)

Общие сведения о сорбционном концентрировании Метод сорбционного концентрирования (ТФЭ) предложен более 20 лет назад и подобен колоночной хроматографии. Он основан на специфических взаимодействиях выделяемого соединения (или мешающих его определению компонентов матрицы) с сорбентом. Типичная схема проведения сорбционного концентрирования приведена на рис.18. Перед началом процедуры сорбент в картридже сухой, поэтому требуется его специальная подготовка к работе. Кондиционирование сорбента проводят растворителем, близким по свойствам растворителю пробы. Так, если проба является водной, то картридж кондиционируют водой. При использовании неполярных С18-сорбентов при проведении сорбционного концентрирования из водных образцов перед кондиционированием водой проводят так называемую «активацию» сорбента небольшим объемом органического растворителя: ацетонитрилом или спиртом. После кондиционирования через картридж пропускают исследуемый образец. При этом иногда пробе придают определенную кислотность, как в жидкостно-жидкостной экстракции, для перевода аналита в необходимую форму. Чаще всего это подкисление фосфорной кислотой или добавка фосфатного буфера с необходимым значением рН


 Рис. Общая схема проведения сорбционного концентрирования

Вместе с молекулами аналита на сорбенте удерживаются и многочисленные примеси из биологической матрицы. На стадии промывки применяются растворители (вода, водно-органические смеси, подкисленные/подщелоченные растворы) для элюирования слабо связанных с сорбентом примесей. Завершающей стадией является элюирование аналита с сорбента. Элюирование стараются проводить как можно меньшим объемом растворителя, который, тем не менее, должен быть достаточным для извлечения целевых соединений с картриджа. При этом некоторые примесные компоненты могут оставаться на сорбенте. Чаще всего элюирование проводят метанолом, ацетонитрилом, добавляя к ним гидроксид аммония или муравьиную кислоту в зависимости от аналита. После завершения процедуры извлечения аналита полученный элюат выпаривают досуха и растворяют в подходящем растворителе, при необходимости осуществляя концентрирование. Иногда элюирование проводят подвижной фазой, чтобы сразу подвергнуть элюат анализу в колонке. 

Подготовка образцов методом ТФЭ может осуществляться двумя сбособами.

1. Удерживающая ТФЭ
Исследуемое вещество и некоторые мешающие компоненты образца задерживаются на сорбенте при прохождении образца через колонку (картридж для ТФЭ). Примеси, взаимодействующие с сорбентом, удаляются при пропускании через картридж слабого элюента. Затем с помощью сильного элюента, добавляемого малыми порциями, исследуемое вещество также снимается с сорбента. Очищенное, сконцентрированное вещество теперь готово для проведения количественного анализа методом ВЭЖХ или другим аналитическим методом.

2. Неудерживающая ТФЭ
Исследуемое вещество не взаимодействует с сорбентом, находящимся в патроне, в то время как все мешающие компоненты осаждаются на сорбенте. Полученный элюат затем можно сконцентрировать при помощи упаривания или отдувки растворителя и исследовать любыми доступными аналитическими методами.

В ТФЭ используются три основных режима разделения: обращённо-фазовый, нормально-фазовый, ионный обмен.

Обращенно-фазовый режим разделения - экстракция неполярных соединений из водных образцов за счёт Ван дер Ваальсовых взаимодействий.

Нормально-фазовый режим разделения - экстракция полярных соединений из неполярных органических растворителей за счёт водородных связей, диполь - дипольных и π-π взаимодействий.

Ионообменный режим разделения - экстракция заряженных соединений из органических или водных растворов с низкой ионной силой за счёт кулоновских взаимодействий.

Метод ТФЭОбращенно-фазовыйНормально-фазовыйСильный ионный обмен
СорбентSDB, C18, C8, PH, CNSilica, Florisil, NH2, CNSAX (анионный обмен),
SCX (катионный обмен)
Свойства исследуемого веществаСлабо полярные (или неполярный), гидрофобные, электрически нейтральные соединения.Фармацев-
тические препараты. Пестициды, гербициды.
Умеренно или сильно полярные, электрически нейтральные соединения.Пестициды.Электрически заряженные вещества.Анионный обмен: анализ веществ, обладающих кислотными свойствами.
Катионный обмен: анализ лекарственных препаратов.
Образец/
матрица
Водорастворимые вещества в буферном растворе.Биологические жидкости. Вода.Неполярные или умеренно полярные органические растворители.Гексан, хлороформ, сложные эфиры, толуол или метиленхлорид.Водные буферные растворы низкой ионной силы (с концентрациями не более 30 ммоль) и точно подобранным значением рНБиологические жидкости плюс буферный раствор.
Стадия кондицио-
нирования
1. Сольватация полярными органическими растворителями
2. Уравновеши-
вание добавкой воды или буферного раствора
1. Метанол
2. Вода или буферный раствор
1. Сольватация полярными органическими растворителями (проводится не всегда)
2. Уравновеши- вание растворителем равным по элюирующей способности с наносимым раствором образца с учетом матрицы
1. Метанол (не во всех случаях)
2. Гексан или хлороформ
1. Кондициони-
рование полярным органическим растворителем
2. Уравновеши-
вание буферным раствором с низкой ионной силой и точно подобранным рН
1. Метанол
2. 25 mM Tris-0Ac, pH 7
Стадия промывкиВодный буферный раствор с содержанием от 5 до 50% полярного органического растворителя.Метанол:вода (1:9)Неполярные органические растворители с низкой концентрацией (от 1 до 5%) слабо полярных органических растворителейГексан с 1% тетрагидро-
фарана, этилацетат, ацетон, ацетонитрил или изопропанол.
Водяной буфер с низкой концентрацией солей с органическим растворителем или без органического растворителя.Анионный обмен: Буферный раствор pH7:метанол (50:50)
Катионный обмен:
1. Буферный раствор pH 6
2. 1M уксусной кислоты
3. Метанол
Стадия элюированияПолярные или неполярные органические растворители с водой или без воды, буферный раствор, сильная кислота или основаниеМетанол:
ацетонитрил: HCl (4:4:2)
Неполярные органические растворители с высокой концентрацией (от 5 до 50%) средне и сильно полярных органических растворителейГексан с 10% тетрагидро-фарана, этилацетат, ацетон, ацетонитрил или изопропанол.
  • Нейтрализует заряд на слабых анионах и катионах
  • Увеличивает ионную силу
  • Повышает концентрацию элюирующих ионов
  • Анионный обмен: гексан:этилацетат (75:25) + 1% ледяной уксусной кислоты
    Катионный обмен: метанол + 5% NH3


    Для достижения требуемых результатов свойства сорбента для сорбционного концентрирования должны отличаться от свойств хроматографической стационарной фазы. Например, сорбент смешанного типа или ионообменный для ТФЭ используется в сочетании с хроматографической колонкой С18. Такая комбинация увеличивает шансы на удаление нежелательных примесей. Часто для заполнения картриджей используются сорбенты на основе силикагеля с иммобилизованными катионными или анионными функциональными группами. Одним из важнейших достоинств таких сорбентов является высокая скорость установления равновесия процессов сорбции и десорбции, позволяющих работать при достаточно быстром пропускания анализируемой пробы. Другим их преимуществом является постоянство объема сорбента при контакте с органическими и водно-солевыми растворами. Сорбенты на основе силикагеля не требуют длительного предварительного набухания и, после проведения кратковременной активации и кондиционирования (либо регенерации) снова готовы к работе. HLB-картриджи представляет собой модифицированный полистистирол, обладающий одновременно свойствами гидрофильности и липофильности. Аббревиатура HLB (Hidrophylic-Lipophylic Balance) в названии сорбента отражает два его важных уникальных свойства: способность оставаться увлажненным водой и способность удерживать широкий спектр полярных и неполярных молекул. Это один из наиболее популярных видов сорбентов для сорбционного концентрирования при анализе лекарственных препаратов в плазме крови. В настоящее время техника сорбционного концентрирования может быть реализована как в виде отдельных картриджей, так и в автоматизированном 96-луночном формате.

    Для ТФЭ характерны более широкие возможности варьирования типов взаимодействий образца с сорбентом и элюентом, чем для жидкостной экстракции, вследствие чего появляются возможности более селективного и количественного концентрирования и/или извлечения аналитов с участием специфических взаимодействий (ионообменные механизмы, сродство к органической фазе.

    Кроме того, следует отметить, что при валидации биоаналитической методики применение сорбционного концентрирования практически полностью обеспечивает соответствие необходимым требованиям по повторяемости и правильности. Тем не менее, у этой процедуры есть и ряд недостатков, основными из которых являются трудоемкость и относительная дороговизна.

    Сверхсшитые полистиролы – уникальный нанопористый сорбционный материал. В основе получения сверхсшитых полистиролов лежит интенсивное связывание цепей полистирола жесткими мостиками. Три фундаментальных принципа образуют концепцию формирования сверхсшитых полимерных сетей. Прежде всего, связывание цепей полистирола должно быть статистически гомогенным, то есть сшивающие мостики должны распределяться случайным образом в конечной сети. Это достигается за счет однородности исходной системы, содержащей длинные полимерные цепи и сшивающий агент. Согласно второму принципу полимер должен оставаться в сольватированном состоянии на протяжении всей реакции. Это значит, что используемый растворитель должен быть термодинамически «хорошим» (энергия взаимодействия растворителя с полимерными цепями превосходит энергию взаимодействия цепей между собой) как для исходных цепей, так и для конечной полимерной сетки. Для выполнения этого условия необходимо, чтобы сшивающий агент не изменял химической природы полимера, то есть имел близкие к нему состав и полярность. И, наконец, образующаяся структура полимера должна быть конформационно жесткой. Это достигается путем 48 интенсивного связывания довольно подвижных цепей полистирола при помощи негибких сшивающих агентов. Отличительная способность сверхсшитых полистиролов набухать под действием любых органических жидкостей является следствием основного принципа формирования сети. Полимер получают за счет фиксации конформаций сильно сольватированных цепей полистирола при введении большого числа негибких связей между ними. Таким образом, в образующейся сети практически отсутствует внутреннее напряжение. При высушивании полимера происходит его сжатие, что вызывает сильное внутреннее напряжение. Поглощение любой органической жидкости приводит к расширению сети и возвращению ее в термодинамически выгодное состояние. Из-за своей структуры сверхсшитые полистиролы имеют развитую поверхность, в то же время способны выдерживать механическое воздействие и взаимодействовать с любой органической жидкостью независимо от ее природы и термодинамических характеристик. Основное преимущество такого типа сорбентов заключается в том, что его поры доступны для низкомолекулярных соединений и при этом недоступны даже для низкомолекулярных белков. По этой причине не требуется никакой дополнительной пробоподготовки: плазма, сыворотка крови или моча могут быть нанесены на картридж непосредственно. Благодаря этому сверхсшитые полистиролы обеспечивают высокую эффективность при анализе различных объектов, включая биологические.