Экстракция в аналитической биохимии и при выделении ксенобиотиков

7. Выделение ДНК из лейкоцитов крови

Выделение общей ДНК из животной клетки не представляет особой сложности, поскольку плазмалемма, ядерная и митохондриальная мембраны «растворяются» в присутствии анионного детергента додецилсульфата натрия (SDS), а сложной клеточной стенки у животных в сравнении, к примеру с растениями, нет. Высвободить ДНК из ДНК-белкового комплекса можно с помощью протеиназ или хаотропных солей. Для этой же цели можно провести как и в случае с бактериями фенольную экстракцию ДНК. Другие вещества при последующем осаждении ДНК спиртом останутся в растворе, и избавиться от них несложно. ДНК можно выделить из любых тканей, клетки которых содержат ядра, но количественный выход из разных тканей может быть различным. Довольно часто для выделения ДНК используют кровь. Лейкоциты крови, в отличие от зрелых эритроцитов, содержат ядра. Общей ДНК, выделенной из 100 мкл цельной крови достаточно для проведения нескольких рестрикций, ПЦР и секвенирования. Митохондриальная ДНК и РНК также присутствуют в получаемом препарате. В приведѐнной ниже методике для освобождения ДНК от белков используется фенол. Под словом «фенол» биологи-молекулярщики часто подразумевают смесь водонасыщенного раствора фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование. 

1. К 100 мкл цельной крови добавить 2 объема дистиллированной воды до конечного объѐма 0.3 мл. Тщательно перемешать и оставить на 15 минут. 

2. Пробу центрифугировать в течение 10 минут, 5000 об/мин. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) слить. 

3. Осадок клеток отмыть двойным объѐмом буфера SSC, добавив в пробирку 200 мкл 1-кратного SSC. Перемешивание аккуратное. 

4. Центрифугировать, как в п.2. Супернатант слить. 

5. К осадку добавить 54 мкл 0.2М ацетата натрия и 6 мкл 10%-ного раствора SDS. Осадок клеток тщательно ресуспензировать, т.е. перевести в суспензию вновь с помощью микропипетки или вортекса. Инкубировать при 37ºС в течение 0.5–1 ч для прохождения лизиса (разрушения) клеток. 

6. Добавить 2 объѐма буфера ТЕ и провести фенольную депротеинизацию образца. Для этого внести в пробирку равный объѐм фенол–хлороформной смеси, хорошо встряхнуть и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний 11 слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу – белый осадок на линии раздела фаз. 

7. Повторить ту же процедуру, что в п. 6, но со смесью хлороформ- изоамиловый спирт для удаления остатков фенола. 

8. К очищенному от белков лизату добавить 1/10 объѐма раствора III, перемешать и высадить ДНК добавив два с половиной объѐма холодного 96% этанола и поместив образец на 1–2 часа в морозильную камеру при –20С. Можно оставить ДНК под спиртом на ночь. 

9. Пробу центрифугировать в течение 10 мин при максимальной скорости микроцентрифуги. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом. 

10. Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 20 мкл буфера ТЕ.