Экстракция в аналитической биохимии и при выделении ксенобиотиков

9. Экстракция липидов

В идеальном случае процедура экстракции липидов должна приводить к количественному извлечению клеточных липидов в неизмененном виде. Липидный экстракт не должен быть загрязнен нелипидными веществами, такими как сахара и аминокислоты. Эффективность экстракции липидов в значительной степени зависит от химической природы липидных компонентов и от вида комплексов, которые образуют липиды в клетке с другими классами природных соединений. Известны три основные типа взаимодействия липидов с другими веществами.

Во-первых, ван-дер-ваальсово гидрофобное взаимодействие «нейтральных» или неполярных липидов, таких как эфиры стеринов, глицериды, углеводороды, каротиноиды, которое связывает относительно слабыми нековалентными связями их углеводородные цепи с другими липидами или с гидрофобными участками белков. Такое взаимодействие осуществляется, в частности, в жировой ткани, хиломикронах, комплексах альбумина с жирными кислотами, жировых образованиях микробных клеток и т.п.

Во-вторых, образование водородных связей – электростатическое или гидрофобное взаимодействие, при котором полярные липиды (фосфатиды, гликолипиды, холестерин) образуют связи с белками, как это имеет место в плазматических мембранах, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и липопротеинах сыворотки.

В-третьих, образование комплексов, в которых жирные кислоты (нормальные или разветвленные) и оксикислоты связаны ковалентными связями (сложноэфирными, амидными или гликозидными) с полисахаридами, как это имеет место в липополисахаридах клеточных стенок бактерий.

Из комплексов, образованных в результате ван-дер-ваальсового гидрофобного взаимодействия, липиды можно экстрагировать относительно неполярными растворителями, такими как этиловый эфир, хлороформ или бензол. Липиды, связанные в мембранах, экстрагируются полярными растворителями, такими как этанол или метанол, разрушающими водородные связи и нарушающими электростатическое взаиможействие белков с липидами. Ковалентно связанные липиды не экстрагируются никакими растворителями; их можно выделить лишь расщепив комплекс с помощью кислотного или щелочного гидролиза.

При выборе метода экстракции необходимо принимать во внимание и химическую природу липидов. Обычно, чтобы предотвратить окисление двойных связей, непосредственно перед экстракцией растворители перегоняют и удаляют из них перекиси. Растворители, применяемые для извлечения высоконенасыщенных липидов, следует дезаэрировать, пропуская через них азот, и затем все операции проводить в атмосфере азота. Липидные экстракты не следует ни упаривать досуха, ни оставлять в упаренном виде на долгое время; извлеченные липиды надо как можно скорее растворять в подходящем растворителе. Температура, при которой проводится экстракция должна быть не выше комнатной (или ниже, если это необходимо) для того, чтобы затормозить окисление и гидролитическое расщепление липидов. Старые способы экстракции кипящим растворителем в аппарате Сокслета должны быть исключены.

Другой фактор, который следует принимать во внимание, особенно при работе с растительными материалами, это ферментативная деградация липидов во время экстракции. Вообще, содержащие спирт смеси растворителей вызывают дезактивацию большинства фосфатидаз и липаз. Более стабильные ферменты разрушаются при 1-2 минутном контакте с кипящей водой или горячим спиртом. Однако, некоторые части растений, как, например, зеленые листья, содержат очень стабильный фермент – фосфолипазу D, которая дезактивируется только при погружении листьев на 1 минуту в кипящую воду или при экстракции кипящим изопропиловым спиртом в течение нескольких минут.

Из вышесказанного следует, что спирт является необходимым компонентом всех смесей, употребляемых для экстракции липидов, так как он разрушает комплексы липидов с белками, растворяет липиды и дезактивирует ферменты, вызывающие расщепление липидов. Однако смест растворителей, содержащие спирт, наряду с липидами экстрагируют содержащиеся в клетках нелипидные вещества, такие как сахара, аминокислоты, соли и т.д. Поэтому неочищенный липидный экстракт нужно обработать так, чтобы удалить все водорастворимые примеси.Наиболее распространенной процедурой такого рода является промывка экстракта водой, приводящая в некоторых случаях к образованию очень стабильных эмульсий. Освобождают липиды от нелипидных примесей, также пропуская неочищенные экстракты через колонки, заполненные целлюлозой или сефадексом, или проводя диализ через специальные мембраны.

Одним из наиболее часто применяемых и эффективных способов экстракции липидов является экстракция по Блайю и Дайэру – упрощенный вариант «классической» методики Фолча. При экстракции по этому методу используют однофазную систему растворителей хлороформ-метанол-вода (1:2:0,8 по объему), которая быстро и эффективно извлекает липиды. Экстракт разбавляют одним объемом воды и одним объемом хлороформа. В результате образуется двухфазная система, нижний слой которой состоит из хлороформа, а верхний – из смеси метанола и воды (1,0:0,9). Водорастворимыне нелипидные примеси переходят в воднометанольный слой, в то время как в хлороформном слое остаются липиды, практически свободные от загрязнений.


Экстракция липидов по Фолчу

10 г тщательно измельченного продукта (с содержанием воды не более 20 %) экстрагируют 3 раза смесью хлороформ-этанол в соотношении 2:1 (50 см3). Первую экстракцию проводят при встря­хивании на аппарате в течение 2 ч, две последующие - по 1 ч.

Раствор отфильтровывают в делительную воронку через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают смесью хлороформ-этанол (4 раза по 10 см3). В дели­тельную воронку добавляют воду (20% от объема экстракта, ин­тенсивно встряхивают и оставляют на ночь до полного разделения хлороформного и водно-спиртового слоев.

Хлороформный фильтрат отделяют от водно-спиртового, пе­реносят в мерную колбу и доводят до метки