Биологическая химия (Фарм 3 курс). Часть 1.

Опыт № 1: Обнаружение активности уреазы (КФ 3.5.1.5.) и установление ее специфичности.

Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины по следующей реакции:

NH₂–CO–NH₂ + H₂O$\rightarrow$2 NH₃ + CO₂

В отличие от мочевины, уреаза не действует на тиомочевину – вещество, структурно сходное NH₂–CS–NH₂.

Техника выполнения.

Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают появление розово-малиновой окраски в пробирке с мочевиной (за счет защелачивания среды аммиаком) и отсутствие окраски в пробирке с тиомочевиной. В протоколе:

·         Опишите принцип определения уреазы

·         Сделайте вывод о виде специфичности уреазы

Опыт № 2: Термолабильность ферментов на примере амилазы слюны.

Амилаза слюны (К.Ф. 3.2.1.1.) расщепляет гидролитически крахмал по следующей схеме:

(С₆Н₁₀О₅)_n $\rightarrow$ декстрины $\rightarrow$ С₁₂Н₂₂О₁₁ ( мальтоза)

Активность амилазы слюны обнаруживают по исчезновению синего окрашивания крахмала при взаимодействии с раствором йода.

Техника выполнения.

Запишите свои наблюдения.

Опыт № 3: Влияние рН на активность амилазы слюны.

Техника  выполнения. В 3 пробирки наливают по 2 мл буферных растворов с различными значениями рН: 1,0; 7,0; 10,0. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 мл слюны (разведение 1:10) и по 1 мл 1 % раствора крахмала. Через 10 минут инкубации содержимое  всех пробирок проверяют  на наличие крахмала реакцией с йодом. Укажите значение рН, при котором произошло полное расщепление крахмала. Нарисуйте график зависимости активности амилазы от рН среды.

Опыт № 4: Количественное определение диастазы (амилазы) в моче амилокластическим методом (по Каравею).

В клинической практике широко применяется количественное определение диастазы (панкреатической амилазы) в моче. Появление этого фермента в моче связано с деструкцией клеток поджелудочной железы при различной патологии и попадании фермента в кровь, а затем через почки в мочу. Уровень диастазы в моче характеризует обширность и глубину поражения поджелудочной железы и, следовательно, тяжесть заболевания. В связи с этим диастаза мочи резко повышается при острых и хронических панкреатитах.

Принцип метода: α-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. При взаимодействии крахмала с йодом образуется окрашенный комплекс, оптическая плотность которого при 640 нм пропорциональна концентрации негидролизированного крахмала. Активность α-амилазы оценивают по уменьшению интенсивности окраски.

Ход определения. В пробирки вносят реактивы по следующей схеме:

Определяют оптическую плотность холостой опытной проб при 670 нм (600–700 нм, красный светофильтр), относительно дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течении 10 мин. Активность α-амилазы выражают в миллиграммах или граммах крахмала, гидролизованного 1 л исследуемого образца за 1 сек инкубации при 37 ºС. Расчет производится по формуле:

Активность, мг/л×сек =44,4 ,

где      А_к – оптическая плотность контрольной пробы;

            А_о – оптическая плотность опытной пробы;

Нормальные величины:

В сыворотке (плазме) крови               3,3–8,9 мг/л×сек;

В моче                                                   до 44 мг/л×сек.

Опыт № 5: Ингибирование трипсина.

Принцип метода. Метод основан на определении количества низкомолекулярных продуктов (пептидов), реагирующих с биуретовым реактивом, после осаждения нерасщепленного высокомолекулярного белка-субстрата. Различие в количестве образующихся продуктов в присутствии ингибитора (опыт) и без него характеризует активность ингибитора.

Техника выполнения. В трех пробирках готовят инкубационные смеси:

·         пробирка 1 (опыт) – инкубационная смесь без ингибитора;

·         пробирка 2 (ингибитор) – инкубационная смесь с ингибитором;

·         пробирка 3 – контрольная проба.

Далее пробы готовят по приведенной ниже таблице.

Содержимое пробирок перемешивают. Сравнивают окраску пробирок, записывают результаты наблюдений и выводы.