Практическая работа к занятию №5.

Опыт № 1: Обнаружение активности уреазы (КФ 3.5.1.5.) и установление ее специфичности.

Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины по следующей реакции:

NH2–CO–NH2 + H2O  \rightarrow  2 NH3 + CO2

В отличие от мочевины, уреаза не действует на тиомочевину – вещество, структурно сходное NH2CSNH2.

Техника выполнения.

Реактивы,  № пробирки

1

2

1. Вытяжка арбузных семян

1 мл

1 мл

2. 1% растворр мочевины

1 мл

3. 1% раствор тиомочевины

1 мл

4. Фенолфталеин

2 к

Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают появление розово-малиновой окраски в пробирке с мочевиной (за счет защелачивания среды аммиаком) и отсутствие окраски в пробирке с тиомочевиной. В протоколе:

·         Опишите принцип определения уреазы

·         Сделайте вывод о виде специфичности уреазы

Опыт № 2: Термолабильность ферментов на примере амилазы слюны.

Амилаза слюны (К.Ф. 3.2.1.1.) расщепляет гидролитически крахмал по следующей схеме:

6Н10О5)n   \rightarrow   декстрины   \rightarrow   С12Н22О11 ( мальтоза)

Активность амилазы слюны обнаруживают по исчезновению синего окрашивания крахмала при взаимодействии с раствором йода.

Техника выполнения.

Реактивы, мл                                               № пробирки

1

2

3

1. 1 % раствор крахмала

0,5 (10к)

0,5

0,5

2. Слюна (разведение 1: 10 ) без кипячения

0,5

3.Слюна (разведение 1:10 ) после кипячения 2–3 мин.

0,5

4. Дистиллированная вода (контроль)

0,5

Инкубируют  все  пробирки  в течение 10 минут

5. Раствор йода

0,05 (1 К)

0,05

0,05

Запишите свои наблюдения.

Опыт № 3: Влияние рН на активность амилазы слюны.

Техника  выполнения. В 3 пробирки наливают по 2 мл буферных растворов с различными значениями рН: 1,0; 7,0; 10,0. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 мл слюны (разведение 1:10) и по 1 мл 1 % раствора крахмала. Через 10 минут инкубации содержимое  всех пробирок проверяют  на наличие крахмала реакцией с йодом. Укажите значение рН, при котором произошло полное расщепление крахмала. Нарисуйте график зависимости активности амилазы от рН среды.

Опыт № 4: Количественное определение диастазы (амилазы) в моче амилокластическим методом (по Каравею).

В клинической практике широко применяется количественное определение диастазы (панкреатической амилазы) в моче. Появление этого фермента в моче связано с деструкцией клеток поджелудочной железы при различной патологии и попадании фермента в кровь, а затем через почки в мочу. Уровень диастазы в моче характеризует обширность и глубину поражения поджелудочной железы и, следовательно, тяжесть заболевания. В связи с этим диастаза мочи резко повышается при острых и хронических панкреатитах.

Принцип метода: α-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. При взаимодействии крахмала с йодом образуется окрашенный комплекс, оптическая плотность которого при 640 нм пропорциональна концентрации негидролизированного крахмала. Активность α-амилазы оценивают по уменьшению интенсивности окраски.

Ход определения. В пробирки вносят реактивы по следующей схеме:

 

Контроль (К), мл

Опытная проба (О), мл

Субстратно-буферный раствор

0,5

0,5

Прогреть 5 мин. При 37 ºС в водяном термостате; все последующие компоненты вносить в пробы, стоящие в термостате.

Образец

0,1

С момента внесения образца выдержать точно 7,5 мин. При 37 ºС.

Раствор соляной кислоты 0,1 н.

4,0

4,0

Образец

0,1

Раствор йода 0,01 н.

0,5

0,5

Определяют оптическую плотность холостой опытной проб при 670 нм (600–700 нм, красный светофильтр), относительно дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течении 10 мин. Активность α-амилазы выражают в миллиграммах или граммах крахмала, гидролизованного 1 л исследуемого образца за 1 сек инкубации при 37 ºС. Расчет производится по формуле:

Активность, мг/л×сек =44,4 ,

где      Ак – оптическая плотность контрольной пробы;

            Ао – оптическая плотность опытной пробы;

Нормальные величины:

В сыворотке (плазме) крови               3,3–8,9 мг/л×сек;

В моче                                                   до 44 мг/л×сек.

Опыт № 5: Ингибирование трипсина.

Принцип метода. Метод основан на определении количества низкомолекулярных продуктов (пептидов), реагирующих с биуретовым реактивом, после осаждения нерасщепленного высокомолекулярного белка-субстрата. Различие в количестве образующихся продуктов в присутствии ингибитора (опыт) и без него характеризует активность ингибитора.

Техника выполнения. В трех пробирках готовят инкубационные смеси:

·         пробирка 1 (опыт) – инкубационная смесь без ингибитора;

·         пробирка 2 (ингибитор) – инкубационная смесь с ингибитором;

·         пробирка 3 – контрольная проба.

Далее пробы готовят по приведенной ниже таблице.

Реактивы

Количество,мл

Опыт

Ингибитор

Контроль

1. Казеин, 5 % р-р

0,5

+

+

+

2. Фосфатный буфер, рН 7,8

1,0

+

+

+

3. Трипсин, 0,01 % р-р

0,5

+

+

+

4. Контрикал, 0,025 % р-р

0,5

+

5. ТХУК, 10 % р-р

1,5

+

6. Н2О

0,5

+

+

Инкубация при 37 ºС в течение 60 минут

7. ТХУК, 10 % р-р

1,5

+

+

Фильтрование

8. фильтрат

1

+

+

+

9. NaOH, 0,5 н. р-р

1

+

+

+

10. Биуретовый реактив

2

+

+

+

Содержимое пробирок перемешивают. Сравнивают окраску пробирок, записывают результаты наблюдений и выводы.


Последнее изменение: Вторник, 20 Сентябрь 2016, 13:24