Практическая работа.

Опыт № 1: Определение содержания общего билирубина в сыворотке крови унифицированным методом Ендрасика-Грофа.

ПРИНЦИП МЕТОДА. Общий билирубин определяется на основе реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой, после диссоциации неконъюгированного (непрямого, свободного) билирубина при участии кофеинового реагента.

Воспроизводимость: коэффициент вариации результатов определений – не более 8%.

Реагенты:

Реагент № 1 – Кофеиновый реагент

Реагент № 4 – Физиологический раствор

Диазореагент – Смесь сульфаниловой кислоты и нитрата натрия

Техника выполнения.

Реагенты

Контроль

Опыт

Образец (сыворотка)

0,2 мл

0,2 мл

Реагент 1

¾¾

1,4 мл

Реагент 4

1,8

0,2 мл

Диазореагент

¾¾ ­­­­­­­­­

0,2 мл

Время инкубации: 20 минут. Температура инкубации: 18-25°С.

 ИЗМЕРЕНИЕ:

Длина волны: 535 нм (500-560 нм).

Длина оптического пути: 1 см.

 

Расчет: Аоп.´ 325 (мкмоль/л)

 

Нормальные величины: 8,5-20,5 мкмоль/л.

 

Опыт № 2. Спектральный анализ гемоглобина крови и его производных.

Гемоглобин  (Нb) состоит из белка глобина и простетической группы гема, содержащего двухвалентное железо. Гемоглобин соединяясь с кислородом воздуха, образует оксигемоглобин – НbО2. При действии на кровь сильных окислителей, двухвалентное железо гемоглобина окисляется в трехвалентное, гемоглобин превращается в метгемоглобин (МНb) и теряет способность присоединять кислород. Гемоглобин и его производные обладают способностью поглощать волны света различной длины и давать характерные спектры поглощения. Исследование спектров поглощения гемоглобина и его производных имеет большое значение в диагностике ряда отравлений (в судебно-медицинской практике и при определении степени профессиональной вредности производства). Если перед источником света поместить пробирку с водным раствором гемоглобина или его производных, то эти вещества будут поглощать часть лучей определенной длины, в результате чего в этих местах появятся чёрные полосы.

 

Спектр поглощения гемоглобина  и его производных.

Техника выполнения.

 

НbO2

Нb

МетНb

Дистиллированная вода

2 мл

2 мл

2 мл

Кровь

1 капля

1 капля

1 капля

Реактив Стокса (аммиачный раствор виннокаменного железа)

5–8 капель

Раствор 5 % К3[Fе(СN)6  ]  

5–7 капель

Полученный в каждой из пробирок раствор рассматривают в спектроскопе.

Спектр поглощения оксигемоглобина

Раствор оксигемоглобина даёт две тонкие полосы поглощения в жёлто-зелёном участке спектра.

Спектр поглощения гемоглобина

Двухвалентное железо реактива Стокса легко окисляется, отнимая от оксигемоглобина кислород и превращая его в дезоксигемоглобин. В спектре появляется одна широкая полоса в желто-зеленой части.

Спектр поглощения метгемоглобина

Жидкость приобретает бурый цвет. В спектре видны три полосы поглощения: две тонкие в желто-зеленой части спектра и третья, наиболее характерная, в красной части спектра. Две полосы в сине-фиолетовой части спектра наш глаз не улавливает.

Зарисовать спектры поглощения гемоглобина и его производных в протокол.

Опыт № 3. Получение кристаллов солянокислого гемина (кристаллов Тейхмана).

Принцип метода. Реакция сводится к образованию кристаллов солянокислого гемина при действии на кровь уксусной кислоты и хлорида натрия. Гемин отличается от гема наличием трехвалентного железа, соединенного с атомом хлора.

Техника выполнения. На предметное стекло капнуть каплю крови и сделать мазок. Осторожно подсушить его. На мазок нанести 2–3 капли раствора NаСl в уксусной кислоте, покрыть покровным стеклом. Нагреть мазок над пламенем горелки до закипания жидкости под покровным стеклом. Охладить. Посмотреть под микроскопом под средним увеличением. Кристаллы солянокислого гемина видны в виде бурых палочек. Зарисуйте их.


Last modified: Monday, 16 January 2017, 4:19 PM