Практическая работа.

Опыт № 1: Количественное определение каталазы крови.

Каталаза - гемсодержащий фермент класса оксидоредуктаз (КФ 1.11.1.6), катализирующий разложение перекиси водорода с образованием кислорода и воды

 Н2О2 + Н2О2 = О2 + 2Н2О. Фермент широко распространен в тканях животных и растений; определение активности каталазы в эритроцитах человека имеет диагностическое значение при анемиях.

Принцип метода: многие каталитические процессы с участием оксидоредуктаз (в том числе разложение ими перекиси водорода) могут быть остановлены добавлением молибдата аммония. В данном методе используется цветная реак­ция молибдата аммония с перекисью водорода, образует комплексное соединение желтого цвета, количество которого оценивается фотоколориметрически.

Техника выполнения

Реактивы

Контрольная проба

Опытная проба

1. сыворотка (кровь)

-

0,2 мл

2. Н2О2 (0,033%) разведение 1: 1000

3,0 мл

3,0 мл

3. Вода

0,2 мл

 

инкубация 10 минут при 370 С

4. раствор молибдата аммония (4%)

1,5 мл

1,5 мл

 

Пробы тщательно перемешивают, и определяют оптическую плотность опытной (Аоп)  и контрольной пробы (Ак), относительно  кюветы с водой на спектрофотометре при длине волны  400 нм

Расчет:

Активность каталазы = (0,391 + 2,63 *∆А) * 33,3  (мг Н2О2 / мкл крови),

где ∆А -  разница  Ак - Аоп

Норма – 22,7 – 34,7  мг Н2О2/ мкл крови

Резкое повышение каталазы крови наблюдается при малой бета – талассемии, повышение – при бета – талассемии. Понижение – при железодефицитной анемии.

 

Опыт № 2: Обнаружение действия пероксидазы.

Принцип метода: Пероксидаза вызывает окисление ряда веществ за счет атомарного кислорода, образующегося при разложении Н2О2 по схеме:

H2O2H2O + [O]

Субстрат +[O] → продукт окисления субстрата

 Наиболее изучена пероксидаза из корней хрена, молекула которой состоит из одной полипептидной цепи (308 аминокислотных остатков), связанной ковалентно с 8 олигосахаридными цепями. Фермент содержит нековалентно связанный гем с атомом железа (у некоторых пероксидаз гем отсутствует). Пероксидазы широко распространены в животных и растительных  клетках (могут находиться как в связанном с клеточной стенкой состоянии, так и в цитоплазме); они участвуют в фотосинтезе, энергетическом обмене, в трансформации пероксидов и веществ, чужеродных организму.

Техника выполнения.     

                                                       

№ пробирок

Экстракт пероксидазы

Пирогаллол

Н2О2 1% р–р

вода

1

-

0,5 мл

2 капли

2 мл

2

2 мл

0,5 мл

-

-

3

2 мл

0,5 мл

2 капли

-

4

2 мл (прокипяченной вытяжки)

0,5 мл

2 капли

-

Перемешивают пробы и наблюдают за изменением цвета жидкости в пробирках. Объясните результат опыта.

Пирогаллол (пирогалловая кислота, 1, 2, 3-тригидроксибензол) — трехатомный фенол, легко окисляется, продукты окисления окрашиваются в коричневый цвет.   

Last modified: Tuesday, 17 January 2017, 9:06 AM